高致病性冠狀病毒密碼子偏愛性分析及S蛋白真核表達重組質粒的構建醫學分析

來源: www.485230.live 發布時間:2020-02-18 論文字數:49899字
論文編號: sb2020021615051629567 論文語言:中文 論文類型:碩士畢業論文
本文是一篇醫學論文,本研究,從 NCBI 下載了所需的冠狀病毒基因編碼序列(CDS),使用 Lasergene子程序 EditSeq 保存截取的蛋白編碼序列;使用 EMBOSS 子程序 CUSP 計算密碼子 Frequency 值;CodonW 計算
本文是一篇醫學論文,本研究,從 NCBI 下載了所需的冠狀病毒基因編碼序列(CDS),使用 Lasergene子程序 EditSeq 保存截取的蛋白編碼序列;使用 EMBOSS 子程序 CUSP 計算密碼子 Frequency 值;CodonW 計算密碼子 ENC、GC、GC3S、RSCU 值。使用 ENC、RSCU 指標,衡量密碼子偏好性;用 ENC-Plot、中性繪圖分析、PR2 分析、聚類分析的方法,分析密碼子偏愛性的影響因素,以及它們之間的進化關系。同時,我們利用分子克隆技術構建高致病性冠狀病毒不同長度的 S 蛋白(SARS-S、SARS-S1、SARS-RBD、MERS-S1、MERS-RBD)的真核表達重組質粒。

第一章 引言

一、冠狀病毒結構及分類
冠狀病毒(coronavirus,CoV)屬于冠狀病毒科、尼多病毒目的成員之一,是廣泛存在于自然界的一大類病毒,可感染人及多種動物[1, 2],并且對人及家畜具有巨大的潛在威脅。冠狀病毒的宿主范圍廣泛,目前已在人及駱駝、豬、牛、雞、鴨、鵝、貓、狗、鼠和蝙蝠等動物中分離到 CoV,可引起呼吸道、消化道和神經系統等的感染[3]。
CoV 因其在電子顯微鏡下為典型的冠狀糖蛋白而得名,其大小在 27kb-32kb之間,是目前已知最大的單鏈正義 RNA 基因組[3]。病毒基因組的 3’端具有 poly(A)尾,5’端具有甲基化的帽狀結構[4]。通常,冠狀病毒三分之二的基因組 RNA 編碼兩個大的重疊多蛋白 ORF1a 和 ORF1ab,它們被加工成病毒聚合酶(RdRp)和參與 RNA 合成或宿主反應調節的其他非結構蛋白。而基因組的另外三分之一編碼四種結構蛋白(刺突(S),包膜(E),膜(M)和核衣殼(N))和其他輔助蛋白。
圖 1.1 冠狀病毒基因組結構圖
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二、冠狀病毒感染細胞過程
動物病毒的增殖過程一般分為五個階段:吸附、穿入、脫殼、病毒組分的合成、裝配與釋放。它是一種必須在活細胞內寄生并以復制方式增殖的非細胞型微生物,因此,進入細胞是其完成復制周期的首要條件,而又因病毒顆粒很大,不能通過自由擴散穿過細胞膜,病毒需要首先粘附至細胞膜上,此環節由病毒與易感細胞表面的特異性結合受體相互結合而完成[1, 24]。
冠狀病毒復制周期是從翻譯病毒基因組的5’端ORF開始(ORF1a和ORF1ab),其合成兩個多聚蛋白 pp1a 和 pp1ab[25]。通過 ORF1a 編碼的蛋白酶進行酶切后,從pp1a 和 pp1ab 上釋放 15 或 16 個復制蛋白酶,在復制酶的作用下,病毒基因組通過不連續轉錄模式(Discontinuous transcription mode),轉錄生成新的基因組 RNA和 mRNA,接著進入細胞質,進行翻譯工作:基因組 RNA 首先開始翻譯,產生病毒 RNA 復制所需的蛋白酶;其次是亞基因組翻譯,產生 S、M、N 和 E 等結構蛋白。在病毒組裝過程中,其結構蛋白 N 與病毒結合,形成復合體形態,該復合體可以通過結構蛋白 M 蛋白、E 蛋白的相互作用,迅速被包裹到核衣殼中。隨后在出芽的過程中,S 蛋白整合到病毒中,形成冠狀結構。最后成熟的病毒顆粒在 M蛋白的作用下從囊泡中釋放出來[26]。具體過程見圖 1.2(以 SARS-CoV、MERS-CoV為例):
圖 1.2 冠狀病毒感染細胞過程
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第二章 高致病性冠狀病毒密碼子偏愛性分析

第一節 六種人冠狀病毒密碼子偏愛性比較
1 實驗材料
本研究涉及的冠狀病毒基因編碼序列(CDS)均來自 NCBI 數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
2 實驗方法
本研究使用 EMBOSS(http://emboss.toulouse.inra.fr/)子程序 CUSP 計算密碼子 Frequency 值[78],CodonW(https://sourceforge.net/projects/codonw/)計算密碼子ENC、GC、GC3S、RSCU 值[79],Lasergene 子程序 EditSeq 保存截取的蛋白編碼序列。使用 Sigmaplot 繪圖、SPSS22.0 進行聚類分析。
3 實驗結果
3.1 有效密碼子數目分析
表 2.1 六種人冠狀病毒的 ENC 值(均值)
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第二節 SARS-CoV 與 SARSr-Co V 密碼子偏愛性比較及聚類分析
1 實驗材料
本研究涉及的冠狀病毒基因編碼序列(CDS)均來自 NCBI 數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
2 實驗方法
方法同上節 2。
3 實驗結果
3.1 有效密碼子數目分析
SARS-CoV 的全基因組由 29727 個核苷酸組成,由 11 個開放閱讀框(ORF)。共編碼 S、E、M 和 N 4 種結構蛋白和 ORF1a、ORF1b、ORF3a、ORF3b、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8 等多種功能未知的蛋白[86]。研究表明,SARS-CoV 與SARSr-CoV 各蛋白有效密碼子數目(ENC)值在 40-58 之間,均接近 61,并且,兩者相同蛋白的 ENC 值非常接近(如表 2.4 所示)。
表 2.4 SARS-CoV 與蝙蝠 SARSr-CoV 的 ENC 值(均值)
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第三章 高致病性冠狀病毒 S 蛋白的真核表達載體的構建...................35
第一節 SARS-CoV S 蛋白真核表達載體的構建.......................................36
1 實驗材料.................................36
2 實驗方法...........................37
第四章 全文小結...............................55

第三章 高致病性冠狀病毒 S 蛋白的真核表達載體的構建

第一節 SARS-CoV S 蛋白真核表達載體的構建
1 實驗材料
1.1 菌株 、質粒
大腸埃希菌(DH-5α)甘油菌購自天根生化科技有限公司;重組 DNA 克隆載體 pcDNA3.1 為本實驗室保存。真核表達載體 pcDNA3.1,大小為 5428bp。pcDNA3.1-SARS 為本實驗室保存。
將稱好的 242 g Tris 堿、37.2 g Na2 EDTA·H2O;攪拌溶解,加入 57.1 mL 冰乙酸;調 PH 至 8.3;充分攪拌后定容至 1000 mL,
4℃保存。
將稱好的 10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物和 10 g Na Cl 溶解于適量去離子水中,用磁力攪拌器攪拌均勻后定容至 1 L,分裝于試管中,然后高溫高壓滅菌 30 min,降至室溫后,4 ℃保存。
將稱好的 4 g 瓊脂,加入到 200 mL 液體 LB 培養基中,于高溫高壓下滅菌 30min,在未凝固前,工作超凈臺下,以無菌操作注入無菌培養皿中,室溫凝固后,4 ℃保存。
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第四章 全文小結

1. 本文采用分子生物信息學技術,分析比較了高致病性冠狀病毒與普通 HCoV、不同宿主間高致病性冠狀病毒的密碼子偏性,發現它們在密碼子的選擇上具有極大的相似性。
2. 本文從密碼子偏性角度基于六種 HCoV、不同宿主間高致病性冠狀病毒的單個基因進行聚類分析,發現六種 HCoV 基于密碼子偏性分析的聚類分析與基于它們全基因組的進化樹分析結果不同;云南蝙蝠 SARSr-CoV 可能是 SARS-CoV、中國其他省份 及行 政區蝙蝠 SARSr-CoV 的 自然疫源地 ;駱駝 MERS-CoV 與人MERS-CoV 在近三年交流比較頻繁,這進一步從密碼子偏性角度證實了 WHO 的最新觀點。
3. 本文利用重疊 PCR 技術克隆 SARS-CoV、MERS-CoV 的 S、S1、RBD 基因編碼序列,成功構建相關真核表達載體。
參考文獻(略)


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